Protocol

1 DNA版

1.1 核酸电泳

琼脂糖凝胶的制备

浓度：琼脂糖（Agarose）浓度在 1%～2%
体积：
- 小格：1×TAE 40 mL，Agarose 0.4～0.8 g
- 中格：1×TAE 60 mL，Agarose 0.6～1.2 g
- 大格：1×TAE 80 mL，Agarose 0.8～1.6 g

取小锥形瓶洗净，加入上述 TAE、Agarose，微波炉加热 2～4 min。
稍微冷却后取出，按 1: 20000 加入核酸染料（GoldView），即 40 mL 加入 2 μL 核酸染料，60 mL 3 μL，80 mL 4 μL。
槽中放入塑料模具，将凝胶倒入模具中，插上梳子。
核酸电泳

孔位于负极（黑色）一侧。
每孔上样 10 μL，marker 用 5～6 μL 即可。
120 V， 30 min。

1.2 组织标本抽提 DNA

步骤：（以小鼠尾为例）

小鼠尾 + 50 μL Buffer L + 1 μL 蛋白酶 K
55 ℃ 30 min
95 ℃ 5 min
离心 > 10000 g，1 min，得到裂解产物作为模版进行 PCR 实验。
注意：裂解后的鼠尾仍可继续用此法裂解。
PCR 20 μL 体系：
每孔 10 μL mix，1 μL primer，8 μL ddH2O，1 μL template。
mix：YEASEN® 2× Hieff™️ PCR Master Mix（with Dye）

1.3 菌液鉴定

目的

鉴定已完成的转化的感受态细胞是否带有目的基因。

步骤

从固体 LB 培养基挑单克隆菌落接种于 1 mL 液体 LB 培养基，并加入 1 μL 抗生素。接种 6 个 EP 管。37℃ 培养箱摇菌过夜。
次日，根据 EP 管中菌液的浑浊程度初步判断菌落生存数量。以此菌液为 PCR 模板做 PCR，20 μL 体系。每管含有

          2× GC buffer                           10 μL

              dNTP                               1.6 μL

           Primer F/R                         0.4 + 0.4 μL

             Enzyme                              0.2 μL

             ddH2O                               6.4 μL

            Template                              1 μ

将除模板外的液体混合成 mix，并留出适当冗余，即需要做 6 孔的 PCR，按照 7 孔的量进行配制。每管先加入 mix 再加模版。
PCR 仪程序设定（待修改）

             95℃                                5 min

             98 ℃                                10 s

             60 ℃                                10 s

             72 ℃                       1 min 转至第 2 步 34×

             72 ℃                               1 min

每管 20 μL 体系，加入 5 μL 5× loading buffer 稀释至 1×。
注意：与鼠尾鉴定相比，菌液鉴定观察到的条带极强，因细菌含有的核酸成分较组织简单。此现象与细菌和组织蛋白 western blot 类似。

1.4 大提质粒（存目）

1.5 小提质粒（存目）

2 RNA 版

2.1 提总 RNA（TRIzol 法）

试剂：TRIzol（4℃），氯仿，异丙醇，DEPC水，75%乙醇

步骤：贴壁细胞；全程至少80 min。

培养皿弃去培养基，至于冰上，用预冷的PBS洗两遍，弃去PBS。
加入1mL TRIzol至培养皿中，吹下皿中的所有细胞。此含有TRIzol的溶液可以-80℃长期保存。
移液至EP管中，吹打混匀，室温静置10 min。
加入200μL氯仿（⅕ TRIzol），左右摇晃15 sec，液体变为草莓奶昔样，室温静置3min。
离心，4℃，12000g，15min。此时液体分三层，中间层最薄。
将上层水相转移至新的EP管中，沿侧壁加入等体积的异丙醇，约500μL，上下颠倒混匀6～10次，室温静置10min。
离心，4℃，12000g，10min。铰链向外。可见RNA沉淀。
弃去上清，注意不要吸到沉淀，可直接倒掉。
加入1mL 75%乙醇，上下颠倒数次，离心，4 ℃，7500 g，5 min。再加入1mL 75% 乙醇，相同条件再离心一次。
弃去上清，开盖倒扣于吸水纸上，静置使残液充分挥发，亦可正置于通风橱中通风。
加入DEPC水30～50μL溶解RNA，上下吹打或vortex 5～10 sec，收集。
用Nanadrop测浓度，一般为3～15 μg/μL，A260/A280 在1.8～2.0范围内。

3 蛋白版

3.1 贴壁细胞提蛋白（裂解液法）

（以六孔板为例）

六孔板吸除培养基，用 PBS 洗两遍，吸除 PBS。注意从培养皿壁加液，不要把细胞从培养皿底吹掉。
冰上，1 mL Triton X-100（或RIPA裂解液）和 10 μL 蛋白酶抑制剂（如PMSF，或磷酸酶抑制剂）混匀。
六孔板每孔加 150 μL，冰上静置30min ~ 1h。
用 200 μL 枪头的底座刮下贴壁细胞，得到悬浊液。
离心 4℃，14000 rpm，10 min。此时蛋白存在于上清中。
取等量上清置于另一套 EP 管，加入 5× SDS 稀释至 1×，95℃ 煮样 8 min。

3.2 贴壁细胞提蛋白（超声法）

六孔板吸除培养基，用 PBS 洗两遍，吸除 PBS。注意从培养皿壁加液，不要把细胞从培养皿底吹掉。
每孔加入热的 2× SDS ___ μL。
弯折 200 μL 枪头，刮下细胞，得到粘稠液体，收集至 EP 管。若不立即超声可冻存。
超声破碎机设置为 30% 功率，开 3 s 停 2 s。每个 EP 管处理 5 个循环。此时管内液体不再粘稠，即为制得的蛋白样品。

3.3 三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白

用途：从培养基上清中提取蛋白

原理：三氯乙酸为酸性化合物，是阴离子型沉淀剂，在低于蛋白质等电点的PH值时，酸根与带正点荷的蛋白质形成不溶性盐而沉淀。作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀。

步骤：（以 10 cm 皿为例）

吸掉皿中的培养基，用 PBS 洗 3 遍，加无血清培养基 3.5 ml，培养 2～4 h，根据细胞状态调整培养时间。
收集培养基，离心，弃去细胞沉淀，加 TCA 至终浓度为 20%，冰上放置 30 min。
最高转速离心 10 min，弃上清。
用 500 μL 丙酮重悬，最高转速离心 10 min，弃上清。
重复上步。
自然风干。
2× SDS buffer 重悬得到蛋白样品，95 ℃ 煮样 8 min。

3.4 组织提蛋白（液氮研磨法）

溶液配制：细胞裂解液（略）

步骤：

1. 取黄豆粒大小的组织（约50ｕg），剪碎后放入液氮预冷过的研钵中，加液氮至完全冻透，研磨至粉末状。

注意：剪碎组织可以提高液氮对组织的冷冻效果，提高研磨效率。

2. 加入1 ml左右裂解液，继续研磨至液体澄清。

3. 吸取全部溶液至离心管中，冰上超声，强度为6，超15 s，停15 s，重复4次。

注意：超声时要将超声探头埋入液体中，还要避免与管壁接触。

4. 离心，15000rpm，4℃ 15 min。

5. 收集上清。

6. 分装样品，冻存于 -70℃。

3.5 组织提蛋白（匀浆法）

组织称重，切小块放入管中。
配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（同细胞提蛋白）。
加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250 mg组织中加入1 ml抽提试剂）。
用匀浆器每次30 s低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1 min，至组织完全裂解。
裂解液于预冷的离心机中14000 g离心15 min。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

3.6 Western Blot

制胶：

梯度胶的制备方法：两块 1.5 mm 玻璃板，7 ml 18% 和 10 ml 6% 的两种胶，先各加 1 ml 18%，再用 1 ml 6% 和剩余的 5 ml 18% 混匀。再用混匀后的胶各加 1 ml，再用 1 ml 6% 混匀……依此做法直至 18% 全部用完。然后用 6% 补至所需要的高度即可。

冬天制胶因气温低，凝固需要较长时间，可以加双倍甚至三倍APS和TEMED。

电泳：

电泳液直接用蒸馏水稀释即可。
样品从冰箱取出后应 55 ℃ 加热数分钟，上样前应充分震荡。每孔上样量一般为20~50 μg 总蛋白。
恒压 80 V，待 Marker 跑开后可调电压至 120 V。若为了防止条带松散弯曲也可用 80 V 跑完全程。
夹板之间的水位过低会导致条带移动变慢（此时电流只有个位数），暂停电泳打开盖子加满电泳液即可。

转膜：

准备好NC膜或PVDF膜，大小视目的蛋白的位置而定，若为了覆盖全部的胶则膜的大小为 5×8 ～ 5.5×8.5 cm²。准备好转膜盘和转膜夹、滤纸，黑胶白膜。
PVDF 膜使用前需要用甲醇激活 3～5 s，但在甲醇中放置数分钟亦可。NC膜不可用甲醇激活，若沾上甲醇则溶解皱缩无法使用。
转膜过程中需保持整个装置在冰浴中进行。
恒流 250 mA ，120 min。

转膜液的稀释：

10×→1×：10× 转膜液 100 ml + 甲醇 200 mL + 蒸馏水 700 mL。
5×→1×：5× 转膜液 200 mL 加入甲醇 200 mL，再加入蒸馏水定容至 1L。
2.5×→1×：2.5× 转膜液 400 mL + 甲醇 200 mL + 蒸馏水 400 mL。
注意：实际操作时避免向转膜液中加入甲醇后结晶，应先向转膜液中加入蒸馏水再加入甲醇。

封闭、洗膜、孵一抗：

转膜完成后用 PBST （或TBST）冲洗，弃去 PBST，加封闭液置于摇床上封闭 15 min～1 h。封闭液可用 PBST 稀释的5％脱脂牛奶或 3％ BSA或明胶。
封闭完成后回收 BSA，用 PBST 摇床上洗膜三次，每次 5 min。若用脱脂牛奶封闭则不用回收。如果一抗的稀释液与封闭液相同，则不必彻底清洗干净。
孵一抗置于 4 ℃ 冰箱摇床过夜，或室温1 h。为节省抗体可将两张膜放在一个洗膜盒中，采用背对背孵育方式。

孵二抗、曝光：

回收一抗，用 PBST 洗膜 3 次，每次 5 min。室温孵二抗 1 h，回收二抗。再用 PBST 洗膜 3 次。
取荧光液 A 液和 B 液（注意更换枪头）各 1 mL 于 2 mL EP管中，混匀后避光保存，尽快使用。一张完整的膜用 1 mL 混合液即可。

不同浓度分离胶的marker分布：

常用的蛋白marker例如Thermo Fisher PageRuler™ 货号 26616。

3.7 质谱（尿素法）

试剂：25 mM ABC，50 mM DTT，50 mM CAA， 8 M urea（尿素），甲酸

步骤：

烷基化：

蛋白质变性：加入 20 μL 尿素到 20 μL 样品中，用无吸附枪头混匀。
断裂二硫键：加入 4 μL DTT，水浴 60 ℃，30 min。
烷基化：加入 12 μL CAA，涡旋振荡，室温放置 45 min。
停止烷基化：加入 4 μL DTT。
分离和溶解样品：加入 20 μL ABC。
消化：加入胰蛋白酶，如2 μL 50 μg/μL或20μL 10 μg/μL，过夜消化。
停止消化：加入20 μL 10% 甲酸（FA），混匀。

纯化上柱：

37℃取出，离心管挖洞，插上有C18柱的枪头。
甲醇活化：在C18柱中加入200 μL 甲醇，离心1200 g，2 min，使得剩余液体的液面恰好在C18柱床上方，并弃流出液。
Condition：Buffer B 200 μL （2次），4000 g，1 min，弃流出液。
Equilibration：Buffer A 200 μL （3次），6000 g，1 min，弃流出液。
稀释（可选）：若蛋白浓度高则需要稀释，用Buffer A定容到200 μL，2000 g，2 min，取上清弃沉淀。
Load：加入100 μL 上述上清，2000 g，2 min，不弃下清液再加另外100μL，2000 g，2min。把下清液（200 μL）重新吸入枪头中，2000 g，2 min，弃下清。
Wash：Buffer A 200 μL（3次）离心6000 g，1 min，弃流出液，随后更换一个新的收集管。
Elute：Buffer B 40 μL（2次）离心，约2000 g，2 min，合并流出液。
在离心浓缩仪中常温旋干。
用25 μL 0.1% FA 溶解上柱。

3.8 质谱（胶内消化法）

详见LTT整理质谱protocol。

3.9 组织芯片评分

判断是正常组织还是肿瘤组织。
判断染色部位是否符合文献报道。
阳性程度：阴性0分，弱阳性1分，中阳性2分，强阳性3分。
百分比：<25% 1分，25-50% 2分，50-75% 3分，>75% 4分。
最终得分为两者相乘。

4 细胞版

4.1 细胞培养方法

人源胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、MKN45、HGC27、SGC7901、SNU-1，正常胃上皮细胞系GES-1均用RPMI-1640培养。人源结肠癌细胞系HCT-8用RPMI-1640培养。

胃癌细胞系KATO-3、腹膜间皮细胞系HMrSV5用IMDM或DMEM培养基。

鼠源胃癌细胞系MFC、结肠癌细胞系CT26、黑色素瘤细胞系B16用RPMI-1640培养。

NK92-MI可用常用培养基另加入多种营养成分，但是建议使用专用培养基。

巨噬细胞RAW264.7使用DMEM培养基。传代时不能使用胰酶消化，尽量不离心，直接吹打、收集后接种至新皿中。

完全培养基 = 空白培养基 + 10%胎牛血清 + 1%双抗（青霉素和链霉素）

生长方式：N87呈岛式生长，KATO-3悬浮生长，其它均为贴壁细胞。

成瘤性：MKN45、SNU-1和N87成瘤性较强，AGS、HGC27成瘤性较差，几乎不成瘤。

   培养器皿       每孔面积（cm^2^）   每孔培养液量（mL）   每孔细胞量（个）

  96孔培养板            0.32                 0.1                10^5^

  24孔培养板              2                  1.0               5×10^5^

  12孔培养板             4.5                 2.0                10^6^

  6孔培养板              9.6                 2.5              2.5×10^6^

3.5 cm 培养皿             8                  3.0               2×10^6^

 6 cm 培养皿             21                  5.0              5.2×10^6^

 10 cm 培养皿            55                  10.0             13.7×10^6^

25cm^2^ 培养瓶           25                  5.0               5×10^6^

75cm^2^ 培养瓶           75                 15～30             2×10^7^

4.2 术语解释

转染 Transfection

转染通常是指将核酸引入真核细胞，或更具体而言引入动物细胞。术语”转染”的经典定义是指摄取感染原核生物的病毒或噬菌体的核酸，导致感染并产生成熟的病毒颗粒。不过，该术语目前的含义包括将外源核酸人工引入细胞。

转化 Transformation

转化通常用于描述细菌、非动物真核细胞和植物细胞中的非病毒 DNA 转移。不过，转化也指导致动物细胞表型永久性改变的特定事件或一系列事件，并意味着遗传不稳定性和向癌变状态进展。尽管从这个意义上而言，转化可由转化病毒感染或基因转染引起，但也可自发产生或在电离辐射或化学诱变剂等外界应激源作用后产生。因此，在描述向动物细胞中引入外源性遗传物质时，应避免使用该术语。

转导 Transduction

转导用于描述病毒介导的 DNA 转移。不过，术语”转染”也用于特指使用从真核细胞病毒或噬菌体分离的病毒核酸感染细胞。

4.3 感受态细胞的转化（Transformation）

试剂

若大提质粒则制备液体 LB 培养基分装于锥形瓶，每瓶 200 mL，高压灭菌；若小提质粒则满足每个离心管装有 7 mL 的量。
若挑选单克隆则需要制备 LB 平板。
抗生素一般为氨苄西林或卡那霉素。

步骤

从 -80 ℃ 冰箱取出感受态细胞（100 μL 分装于 EP 管），按照质粒名标记，瞬离。
2 μL 质粒加入至 100 μL 感受态细胞中，混匀。
冰浴 30 min。水浴锅 42 ℃ 预热。（若不挑选单克隆则水浴加热抗生素使其融化）
热激，42 ℃， 90 s。
冰浴静止 2 min。

不挑选单克隆

全部加入至 200 mL LB 培养基中，并按 1:1000 的比例加入抗生素，即加入 200 μL 氨苄西林或卡那霉素。
置于 37℃ 恒温振荡培养箱摇菌过夜，至少 16 h。

挑选单克隆

每个 EP 管加入 1 mL LB 培养基，置于 37℃ 摇床 1 h。
离心 400 g 3 min，吸除部分上清，用剩余的上清液重悬，目的在于浓缩菌液。
按照抗性需求选择固体 LB 平板，每板加 50 μL 摇菌后的液体和十余粒玻璃珠，在前后方向和左右方向上快速移动，持续数分钟，使菌液均匀涂布于平板上；也可用弯折的 200 μL 枪头涂板。
回收玻璃珠，待平板内液滴干燥后倒置于 37℃ 细菌培养箱过夜。
第二天，用小枪头蘸取单独一个菌落接种到 200 mL 液体 LB 培养基中，轻轻吹打，保证全部接种。注意：一个锥形瓶仅接种一个菌落，枪头不能碰到其它菌落。
按 1:1000 的比例加入抗生素，即加入 200 μL 氨苄西林或卡那霉素。
置于 37℃ 恒温振荡培养箱摇菌过夜，至少 16 h。

注意：上述使用 200 mL LB 培养基适合后接大提质粒，若后接小提质粒则使用 15 mL 离心管加入 7 mL LB 培养基摇菌。

4.4 瞬时转染

转染 293T

转染前 1 d，胰酶消化 293T 细胞，取适量细胞接种到 2 个培养皿中，使其在转染时细胞密度为 70～90%。
计算：
- 质粒用量：10 cm 的培养皿可用 10～20 μg，六孔板每孔使用 2 μg。质粒浓度单位为 ng/μL，操作前应计算好质粒的体积（μL）。
- PEI 用量：质粒用量的三倍（数值上），即质粒使用 10 μg，PEI 使用 30 μL。
- Gibco® Opti-MEM 用量：10 cm 的培养皿使用 1 mL，六孔板每孔使用 200 μL。
取 EP 管加入上述 3 种试剂，震荡，瞬离，静置 15 min。
沿培养皿壁加入到皿中，轻轻混匀，记录时间点。
大皿 4～6 h 后换液，六孔板无时间要求。过程中不要用 PBS 洗。
转染完成后，理论上应收获部分细胞做 PCR 及核酸电泳验证转染成功，但实际上有时荧光很强，肉眼可直接观察到。

转染肿瘤细胞

质粒、Lipo2000 和 Opti-MEM 的用量均同上。
质粒加入一半 Opti-MEM，静置 5 min；Lipo2000 加入另一半 Opti-MEM，静置 5 min。
上述两者混合，静置 15 min。
……

4.5 稳定转染

转染前一天将细胞铺于六孔板，细胞密度以转染当天约 50% 为宜。
收 293T 转染后 24～48 h 的培养基，离心 500 g 5 min，弃去沉淀。
上清用 0.45 μm 滤器过滤，用新的离心管收集。
吸除六孔板的培养基，将过滤后的培养基沿壁加入，每孔 2 mL。
按 1:1000 加入 8 μg/μL Polybrene，即每孔加入 2 μL，记录时间点。
4 h 后每孔补充等量培养基 2 mL。
转染 24 h 后，换成 2 mL 新的培养基。
转染 48 h 后，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 表达效率；对于携带嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因的病毒，加入适量嘌呤霉素，筛选稳定转导的细胞株。

4.6 Transwell 小室侵袭试验

原理

对实验结果产生影响的变量：细胞数量，培养时长。

实验步骤

6 μL/Vial 分装的 Matrigel 胶用冷的无血清培养基以 1:50 稀释，即每管加入 300 μL 培养基。
吹打混匀，在每个小室内加入 130 μL 稀释后的 Matrigel 胶，小室置于 24 孔板中，轻拍 24 孔板边缘，确保铺满小室底部。
置于 37℃ 等待 2 h 使胶凝固。
在此期间，消化待实验细胞，离心后用培养基重悬，进行细胞计数。
2 h 后，取出 24 孔板，吸除小室中残留的培养基，此时小室中仅有已经凝固的 Matrigel 胶。
下室加 600 μL 有血清培养基，上室加待实验细胞，细胞数为 1×10^5 个，体积不超过200 μL。
37℃ 培养 24～48 h 后从细胞培养箱取出，记录培养时长。
用 PBS 洗 3 次：在下室加 800 μL PBS，上室加 200 μL PBS，轻拍 24 孔板边缘。
用 4% 多聚甲醛固定侵袭滤膜的细胞：在下室加 800 μL 多聚甲醛，上室加 200 μL 多聚甲醛，室温静置 20 min。
PBS 洗 3 次。
结晶紫染色：在下室加 800 μL 结晶紫染液，上室加 200 μL 结晶紫染液。室温避光静置 1 h，亦可室温避光静置过夜。
PBS 洗 3 次。
用蘸有 PBS 的棉签擦去未侵袭滤膜的细胞。
显微镜下计数侵袭细胞数并拍照。

注意事项

Matrigel 使用前应从 -20℃ 转移到 4℃ 待其自然融化，如 4℃ 放置 2 h 或过夜放置。为避免反复冻融，可分装为 6 μL/Vial。

4.7 Transwell 小室侵袭试验（分泌蛋白）

原理

分泌蛋白是指在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质，如唾液淀粉酶、胃蛋白酶等。体外培养细胞时分泌蛋白即存在于培养基中。因此，为研究分泌蛋白对细胞侵袭能力的影响，应使用含有和不含有该蛋白的培养基来培养待实验细胞。

步骤

两皿 293T 细胞分别转染空质粒和目的基因质粒。
吸除培养基，用 PBS 洗两次，吸除 PBS 后加入 3 mL 无血清 DMEM 培养基饥饿培养 4 h。
4 h 后吸取培养基 500 g 离心 3 min，弃去沉淀。
消化、离心待实验细胞后用此上清重悬，计数后加到已经铺 Matrigel 胶的 Transwell 小室中。
37℃ 培养数小时后，固定、染色、观察。

4.8 CCK-8

试剂：碧云天CCK-8试剂盒

步骤：

细胞铺 96 孔板，每孔2000~10000个细胞，每孔100μL培养基。每孔加入 CCK8 10 μL（培养基的1/10），2 h 后每孔吸出 100 μL 置于新孔，注意不能产生气泡。测 450 nm OD 值。若蒸发过多导致剩余液体不足 100 μL，可取 50 μL 测 OD 值再乘 2。
对比：OV 和 OV-NC，另需测 5 个不含细胞的孔；时间上按照 0 h、24 h、48 h、72 h 进行实验。

4.9 细胞计数

细胞消化后充分吹打，制成单个细胞悬液。
吸出10μL充入细胞计数板中，可根据需要进行稀释后吸10μL充入计数板中。
计数四角大方格内细胞总数。
每毫升细胞数（单个细胞悬液）=总数/4*10^4。若稀释则再乘稀释倍数。合理的计数结果为200~500/mm²。

4.10 细胞粘附试验（cell adhesion assay）

目的

研究细胞与细胞间的粘附能力，通常探究肿瘤细胞与间质细胞间的粘附能力。

原理

有两种细胞粘附试验，分别为细胞与基质、细胞与细胞，此法为细胞与细胞间的粘附试验。

钙黄绿素AM（Calcein AM）是一种活细胞染料，本身无荧光。进入活细胞后被酯酶切去AM基团产生Calcein，产生绿色荧光且短时间内不能排出细胞，达到对活细胞染色的效果。

步骤

根据实验计划，预先将间质细胞铺板。
用PBS或无血清的培养基稀释Calcein AM至终浓度2～5μM，终体积为96孔板每孔100μL，6孔板每孔1mL，大皿每皿6mL。
待染色细胞吸除培养基上清，PBS洗两遍，加入稀释后的Calcein AM染料，避光孵育30min～45min。此时Calcein AM被吸收至细胞内。
孵育完成后，吸除上清液，用PBS洗一遍，加入适当完全培养基继续培养30min。此时Calcein AM被酯酶水解。
吸除上清液，PBS洗一遍，用胰酶消化细胞，收集，离心。用培养基重悬后进行细胞计数，取最大数量细胞接种至已铺板的间质细胞皿中。培养基一般选用被染色细胞的培养基；若1640与DMEM则选1640，因DMEM含有高糖可能对细胞造成损伤。
3h后，吸除培养基上清，PBS洗三遍，荧光显微镜观察。

注意

细胞被Calcein AM染色后不可固定。
若用共聚焦显微镜拍照则需使用专门的玻璃底皿，参考外泌体染色与摄取试验。

4.11 患者来源类器官（PDO）的制作（存目）

参考bioGenous产品说明书。

4.12 流式细胞术

试剂与器材

流式抗体（如CD3-FITC，CD4-APC，CD8-PE，CD11c-FITC，CD80-APC，CD86-PE等），消化酶（包括脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ），胶原酶Ⅰ型（Collagenase Ⅰ），胶原酶Ⅳ型（Collagenase Ⅳ），透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）），裂解液；小剪刀数把，尼龙布（提前剪成小块）；低温台式离心机

步骤

溶液配制：FACS为含1% (v/v）FBS的PBS，组织消化液为四种酶（DNaseⅠ10mg，Collagenase Ⅰ100mg，Collagenase Ⅳ100mg，HAase 100mg）溶解于66.6mL的完全培养基（通常用DMEM）中。
取组织：若研究DC成熟则取肿瘤侧腹股沟淋巴结置于PBS中，剪碎；若研究T细胞比例变化则取肿瘤组织。
消化：离心1800r/min，5min，弃上清。加组织消化液100μL重悬，37℃消化1h，每10min振荡1次。
过筛：加入FACS 1mL终止消化，用200目尼龙布或细胞筛过滤，滤液置于新EP管。
洗涤：离心1800r/min，3min，弃上清。加FACS洗涤1次，弃上清。再用FACS重悬沉淀，体积可为100~500μL，视样品而定。
分管：肿瘤组织细胞量一般较大，可以稀释成500μL，混匀后取100μL用于后续实验，或者稀释为1/8甚至1/10。
先取3管每管100μL用于单染，取1管100μL作为空白管，一组指标只需一套单染管和空白管。
若对同一样品同时研究两组指标（如DC成熟和T细胞比例变化），则需将剩余体积按每份100μL分开用于混染，即上一步骤用FACS重悬至少需200μL。
染色：每管中每种抗体需0.3μL，用FACS稀释至10μL再混合。
以研究DC成熟为例，每管加入30μL稀释后的染液，30μL包含CD11c、CD80、CD86各0.3μL。若有25管待染样品，一套单染管，另加两管的量用作冗余，共28管，则需要将三种抗体各8.4μL分别溶于280μL FACS。先各取10μL加入到单染管中混匀，剩余混合得到810μL混染液，样品管每管加入30μL，避光染色1h。
若研究肿瘤组织T细胞比例变化则使用CD3、CD4、CD8三种抗体。
洗涤：染色完成后离心，去上清，加500μL FACS重悬、离心1~2次。
上机：加400μL FACS重悬，流式上机。

注意

Treg：取肿瘤FACS悬液加入CD3、CD4染色1h后，离心去上清，加入固定液，固定1h以上，离心弃上清，加入裂解液裂解重悬____min，离心，最后在裂解液中染Foxp3 1h，离心弃上清，FACS清洗1遍后测流式。

CD8、CD4、Treg一起染：FACS细胞悬液，先加anti mouse CD16/32 block位点，每样0.2μL，4℃染15min，不用洗，直接加Alex 488-CD45（染所有淋巴细胞），APC-CD3，APC-Cy7 CD4，percp-Cy5.5 CD8a，混液（每种每样加染料0.3μL）染1h，4℃。用FACS洗一遍，加入固定液固定45min以上，离心去上清加入破膜液洗一遍，离心取上清。将PE-Foxp3稀释在破膜液中，染1h，4℃，离心，用FACS洗一遍加FACS重悬跑流式。

4.13 免疫荧光（γ-H2AX染色）

目的

探究某药物可使细胞发生DNA损伤且可增敏辐射。

试剂与器材

PBS，4%多聚甲醛，抗体（γ-H2AX一抗、二抗、DAPI），Triton-X，BSA，抗荧光淬灭剂；爬片或共聚焦皿，孔板，湿盒；共聚焦显微镜

步骤

铺板：细胞爬片或共聚焦皿。
用药：24h后，按照实验分组加药。
辐照：24h后照射线，6Gy。照射后继续培养1h。
固定：吸除培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定10min，PBS洗3次。
破膜：用含0.2% Triton-X的破膜液（用PBS稀释）处理细胞10min。
封闭：吸除破膜液，用封闭液（1% BSA溶于破膜液）处理细胞1h。
孵一抗：用封闭液按1:500稀释一抗（具体稀释倍数查阅说明书或根据预实验得出），剪一段封口膜置于孔板盖子上，滴10μL在封口膜上，用针头和镊子小心取出爬片倒扣在一抗上。4℃过夜。
洗涤：将爬片重新放回孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS洗3次，每次3min。
注意：此洗涤步骤极为重要！
孵二抗：用封闭液按1:1000稀释二抗，孵育方法与孵一抗相同，置于湿盒中，37℃ 1h。
洗涤：将爬片重新放回孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS洗3次，每次3min。
染核：吸除PBS，用DAPI孵育5min。吸除DAPI，PBS洗3次。
抗淬灭：吸除PBS，每个爬片滴一滴抗荧光淬灭剂，确保覆盖爬片所有面积。
制片：用针头和镊子小心取出爬片，倒扣在载玻片上，避光4℃保存，一周内拍上机拍摄。

4.14 细胞膜提取（未整理）

方法一

细胞收集，用PBS清洗三次，在4℃冷Tris 缓冲液(pH=7.4)中重悬1小时(缓冲液包括10mM KCl，2mM MgCl₂，20mM Tris 和1×蛋白酶抑制剂)。然后在0℃超声仪中超声 10min (60%功率，2s工作，暂停3s)。然后在4℃下10000×g 离心上清 10min以分离其他细胞器(4℃ 20,000g 30min)。

将得到的上清液在 100,000×g下离心1h，收集细胞膜，用10mM Tris重悬后超声，通过 400nm的聚碳酸酯膜挤压20次。然后，材料溶液与细胞膜的混合物超声5min，然后通过400nm的聚碳酸酯膜挤压20次，14,800rpm离心15min（质量比1:1，体系1mL 超声10min)。

方法二

孵育后，用细胞刮刀收集融合的细胞，并用冷PBS 洗涤两次。然后，将获得的细胞颗粒进一步悬浮在含有苯甲基磺酰氟的低渗裂解缓冲液中，并在冰浴中孵育 15 分钟。然后，使用重复冻融法将融合的细胞破碎三次，并在4℃下以700×g的速度进一步离心 10 分钟。

收集上清液并进一步以14,000×g 离心30分钟以收集破的细胞膜。将细胞膜碎片冷冻干燥并储存在-80℃下以备进一步使用。4T1细胞膜和RAW264.7膜的提取方法与上述相同。

4.15 骨髓单细胞悬液制备

骨髓单细胞悬液制备新方法，福麦斯生物微信公众号，2024年7月3日，https://mp.weixin.qq.com/s/IHMDO3N2Y7Qizf_VXwjjxQ

制备

处死小鼠，剥离整个下肢的皮肤和肌肉，使骨完全暴露，小心不要切断骨头；
通过切断髋关节上方来切除整个腿，小心不要切断股骨的顶部；
用低尘擦拭纸擦拭骨头，用镊子夹住股骨和胫骨，用剪刀在骨髓末端切开，露出骨髓；
使用18号针穿刺0.5 ml ep管的底部（针尖可以点火）；
将四根切开的骨头放在管的底部，并在管中加入200 μl PBS；
将0.5 ml的试管与骨一起放入一个1.5 ml的试管中，6000 g离心1min；
将0.5 ml管与骨一起丢弃，将BM细胞重悬于1.5 ml管中，300 g再离心5 min；
用PBS重悬，清洗骨髓细胞，通过一个40 μm的细胞过滤器过滤，裂红。

保存

处理方法	保存方法和时长	注意事项
Human：新鲜样本采集后置于肝素钠抗凝剂中 \| ①T细胞检测，室温下肝素钠抗凝保存48 h； \| 不宜采用其他抗凝剂，因骨髓穿刺液样本与枸橼酸葡萄糖液的比例不是最佳时易导致PH值的改变，从而降低细胞的活性。 \| \| \| \| ②B细胞检测4℃保存72 h； \| \| \| \| \| ③单核及髓系表型检测4℃环境下可保存48 h； \| \| \| \| ④高分化淋巴瘤样本检测建议采集后立即检测。 \| —-+—-+—-+ Mouse：根据上述单细胞悬液制备方法制备后，重悬于无菌培养基或者PBS中 \| ①活细胞：单细胞悬液使用FACS buffer 4℃保存24 h。 \| 冰上裂红，裂红时长不超过l min；固定后的细胞使用1%甲醛或多聚甲醛缓冲液重悬时，该缓冲液应现配现用。 \| \| \| \| ②固定细胞：采用 4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，离心洗涤，1%甲醛的磷酸缓冲液重悬细胞沉淀，4℃保存1周。 \| \|

4.16 原代细胞提取和培养（DC细胞）（存目）

骨髓源树突状细胞的提取和培养技巧分享，武汉普诺赛微信公众号，2024年9月19日，https://mp.weixin.qq.com/s/4f1R8CzbAU2bpMNzPaVE_g

5 外泌体版

5.1 提外泌体（超速离心法）其一

Exosome-loaded degradable polymeric microcapsules for the treatment of vitreoretinal diseases. Nat. Biomed. Eng 8, 1436–1452 (2024). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01112-3

细胞接种 10 cm 皿培养至 90% 密度。
PBS 洗两遍，换无血清培养基 8 mL。
24 h 观察细胞，若状态差则收培养基，若状态良好则 48 h 收培养基。
培养基上清离心 300 g，10 min，沉淀为活细胞。
弃去沉淀，上清离心 2000 g，10 min，沉淀为死细胞。
弃去沉淀，上清离心 10000 g，30 min，沉淀为细胞碎片。
弃去沉淀，上清离心 100000 g，70 min，沉淀为外泌体和蛋白污染物。
用 PBS 重悬，离心 100000 g，70 min，沉淀为外泌体。

5.2 提外泌体（超速离心法）其二

细胞接种 10 cm 皿培养至 90% 密度。
PBS 洗两遍，换无血清培养基 8 mL。
24 h 观察细胞，若状态差则收培养基，若状态良好则 48 h 收培养基。
培养基上清离心 300 g，10 min，4 ℃，沉淀为活细胞。
弃去沉淀，上清离心 2000 g，10 min，4 ℃，沉淀为死细胞。
用0.22 μm滤器过滤，滤掉细胞碎片和大颗粒。滤液可置于-4℃或-80℃冰箱保存以备后用。
超速离心，35000 rpm或210000 g，70 min，4 ℃。转子为SW41Ti。
弃去上清，沉淀通常肉眼不可见，用记号笔标记沉淀大致位置。加入少量过滤后PBS重悬，涡旋2-3 s混匀。
离心70 min，同步骤 7，倒掉上清，用残留在管中的PBS重悬并涡旋混匀。

5.3 提外泌体（超滤法）

４℃ 300 g离心 10 min除去残余细胞。
如果不够澄清，４℃ 2000 g离心20 min进一步除去细胞碎片，小心收集上清。
用0.22μm 孔径过滤器过滤，PES膜的针头过滤器过滤样品，对样品进行澄清。
用PBS 平衡Amicon Ultra-4（如果样品上清不超过4ml）或Amicon Ultra-15 超滤管 ( 100 kDa MWCO) ，离心 4000 g 10 min，从超滤管内管及收集管吸走PBS。
向超滤管加入样品，4000 g 离心 30 min 浓缩样品。
倒空收集管，加入3或14 mL PBS 进行缓冲液置换，温柔吸打样品数次。4000 g 离心 30 min.
从浓缩管吸回处理好的样品 (约30X 浓缩) 。
如果还想进一步浓缩，将样品加入3 kDa MWCO超滤管中再进行一次超滤浓缩。

5.4 外泌体染色与摄取试验

器材：Amicon-100K超滤管，水平转子低温离心机，35mm玻璃底皿（可观察区域20mm）（或圆形细胞爬片和载玻片），共聚焦显微镜，摇床

试剂：Sigma PKH67染料试剂盒，碧云天Hoechst 33342染料（或DAPI染料），碧云天抗荧光淬片封片液（或含有DAPI染料的封片液），滤后PBS，无外泌体的培养基

步骤：

染色前一天，消化待侵染细胞，计数，接种到共聚焦显微镜专用的35mm玻璃底皿中，每皿约8000-10000个细胞，1.5 mL培养基。可根据细胞生长特性调整接种数量，最多可接种50000/皿。若使用细胞爬片则在12孔板中放入爬片然后铺板。
注意：因爬片极薄，确保每孔只放置了一张爬片，否则会影响共聚焦显微镜对焦。
染色当天：提好的外泌体用100K超滤管离心，水平转子，4℃，4000 g，5 min。（若用角转子则为5000 g，10-20 min，滤器的两个平面分别朝上和朝下。）150μL原液大约可浓缩为20μL。
取10μL（根据外泌体浓度调整）浓缩后的外泌体加入新的EP管中，再加入125μL（根据外泌体浓度调整） Diluent C。另取1个EP管加入0.5μL PKH67染料和125μL Diluent C。两者各自充分混匀。
混合上述两个EP管，充分混匀，冰上孵育1-5 min。
注意：必须先分别用Diluent C稀释外泌体和染料，再将两者混合，否则将导致染色不均匀。
去除未结合的染液：100K超滤管离心，水平转子，4℃，4000 g，5 min。得到约20μL浓缩液。
孵育：根据试验设计用少量（如500μL或1mL）non-exo PBS稀释上述浓缩液，即为已染好的外泌体；事先铺在玻璃底皿中的细胞吸除培养基，用non-exo PBS洗两遍，再加入1.5 mL non-exo 培养基。加入已染好的外泌体，混匀，置于细胞培养箱培养6 h。
固定：non-exo PBS洗3次，每皿加入500μL多聚甲醛，10-20 min后吸除，并用PBS洗去多聚甲醛。
染核：建议使用含DAPI染料的抗淬灭封片液，滴1-2滴盖住观察区域即可，静置数分钟可镜下观察。或使用单独的细胞核染料和封片液，如将Hoechst染液用non-exo PBS稀释到1×，每皿加入少量染液，覆盖住皿底细胞即可。室温静置3-5 min。
抗淬灭：吸除Hoechst染液，用non-exo PBS摇床洗2-3次，每次3-5分钟。用1mL枪头滴两滴抗荧光淬灭封片液。
共聚焦显微镜观察：大多数染料在共聚焦显微镜软件中可直接选取，如DAPI、Cy5.5等，若没有所需染料可查阅说明书选取相近的激发波长。PKH67最大激发波长490 nm，最大发射波长502 nm。Hoechst 33342最大激发波长346 nm，最大发射波长460 nm。

5.5 外泌体的透射电镜成像（TEM）

取铜网置于滤纸上，取20μL外泌体滴于铜网，烘干或过夜晾干。
滴少量磷钨酸复染，烘干/晾干。重复2-3次。
电镜观察。

6 动物版

6.1 植瘤

注意：CT26只能植balb/c小鼠

6.2 裸鼠胃原位移植瘤

流程

2022-11-08：MKN45-GFP（NC）细胞状态好，荧光强，细胞注射于三只裸鼠，一只右侧腋下、一只双侧腋下、一只背部(后死亡)，IVIS定期检测肿瘤生长（分别于11-16、11-28IVIS，荧光强），肿瘤生长快、体积大。

2022-11-28：皮下瘤移植至裸鼠胃原位，28只，术后成活27只，其中第1只操作时间长，老鼠关腹时死亡。平均操作7~10分钟/只。术后约半小时苏醒。

具体操作细节

提前6~8分钟麻醉（10 ul/g，如20 g，最多腹腔注射200 ul），待深睡后，于操作台平卧位，四肢胶带固定，铺手术单、腹部剪开小洞，安尔碘消毒腹部皮肤，于剑突下或偏右侧（即小鼠左侧）0.2-0.5 cm处用小剪刀切皮，切口约0.5-1 cm，小镊子夹起腹肌，剪开小口（0.5 cm左右）进腹，左手用小镊子夹起左侧壁腹膜以暴露腹腔，右手持小镊子在肝下缘偏右侧的肝后方轻轻夹起胃或小网膜，左右手交替牵出胃（呈白色），可见胃右侧根部固定拉不动。左手提起胃窦部，右手持针器夹持4-0单针于胃前壁或大弯侧挑起一点浆膜，向上稍用力挑断，可见浆膜下层翻出，然后于该点两侧浆膜下层缝一针（约2-4mm），贯穿待移植肿瘤组织，轻轻打结固定即可，剪线。逐层关腹，先缝合壁腹膜1-2针或8字缝合，然后缝皮。最后安尔碘消毒伤口，置于刨花垫料笼盒复苏。

注意事项

准备刨花垫料笼盒
室温空调26-28℃
保温垫提前预热后拔掉开关、以防垫子过热
准备手术器械:小剪刀、小镊子(带齿)、大持针器、生理盐水、纱布、注射器(1/10ml)、酒精/安尔碘棉球、大皿若干、胶带、手术单若干、4-0八根针可吸收线(多备一些，平均一根可操作性两只裸鼠)、冰盒
准备新鲜肿瘤组织:处死小鼠，酒精消毒整只小鼠，解剖出皮下瘤，浸没于生理盐水，清洗一次，切成小块(1-5mm左右)，置于生理盐水备用;剩余肿瘤组织置于冰上备用

LDB

2022-11-29

6.3 IVIS生物分布

目的：

检测注射药物后不同时间点小鼠体内药物分布的情况，通常用于证明在肿瘤、肝脏等器官中富集较其它器官明显。
检测除皮下瘤模型以外的无法直接测量的肿瘤模型的生长情况，如直肠原位癌模型、脑部原位癌模型等。

器材和试剂：IVIS成像设备（活性区IVIS电脑用户名和密码为9127，IVIS软件用户名为SWH，密码为1989），尾静脉注射仪，Living Image®软件等。

步骤：（以药物的生物分布为例）

0时：尾静脉注射药物（事先连接有荧光染料，如Cy5.5、DiD等），在注射前先拍一张作为0时的图像，或者拍摄时不开汞灯作为0时的图像。软件应设置为荧光（fluorescence）而非生物发光（bioluminescence）。
注意：用转染了荧光素酶（luciferase）的细胞建模时应在拍摄前腹腔注射荧光素钠并在软件中选择生物发光，用转染了GFP的细胞建模时无需注射荧光素钠，软件应选择荧光。
另选几个时间点拍摄，常用的时间点如1时、2时、4时、8时、12时、24时，或1时、3时、6时、12时、24时、48时，根据药物代谢速度进行调整。
用Living Image®软件处理数据。

7 核医学版

7.1 多肽标记 DOTA-NHS-Ester

多肽(1 mg，分子量1428.71 Da）标记DOTA-NHS-Ester

试剂与材料准备

试剂	配制要求	用量计算
多肽	分子量 1428.71 Da，用量 1 mg	摩尔数 = 0.5 mg / 1428.71 g/mol ≈ 0.35 μmol
DOTA-NHS-Ester	分子量 539.5 g/mol（CAS 170908-81-3）	摩尔比多肽:DOTA-NHS = 1:10 → 需 3.5 μmol（约1.888 mg）
缓冲液	HEPES（pH＞等电点）	溶解多肽：50 μL（终浓度7 mM）
有机溶剂	无水DMSO（色谱级，干燥保存）	取10mM DOTA-NHS 350μL
淬灭试剂	0.1 M醋酸铵（pH 5.6）	淬灭用量：反应液体积的10%
纯化溶剂	HPLC流动相：A：0.1% TFA/水；B：0.1% TFA/乙腈	梯度洗脱用

💡 关键点：

DOTA-NHS需避光操作，现配现用；多肽溶解前需确认无沉淀。
禁用含伯胺缓冲液（如Tris、甘氨酸），否则竞争消耗DOTA-NHS。

详细合成步骤

步骤1：溶液配制

多肽溶液：

取1 mg多肽，溶于 100 μL HEPES（pH 8），涡旋混匀至完全溶解（终浓度 25 mM）。
取50 μL多肽溶液反应

DOTA-NHS溶液：

称取5 mg DOTA-NHS 溶解于1mL DMSO，配置约10mM的DOTA-NHS。
取10mM DOTA-NHS 350μL。

步骤2：偶联反应

混合反应体系：

将DOTA-NHS/DMSO溶液逐滴加入多肽溶液中（冰浴操作），滴加时间≥1分钟。
体积比：水相（多肽）: 有机相（DMSO）≈ 1 : 9.5（终DMSO浓度≈90%）。

反应条件：

温度：4°C（减少水解副反应）
时间：2小时（混匀）

步骤3：反应淬灭

直接加入0.5ml 醋酸铵缓冲液（pH 5.6）室温反应15min终止反应。
3K超滤管超滤

步骤4：粗产物鉴定（RP-HPLC）

HPLC条件：

色谱柱：C18反相柱（5 μm, 4.6×250 mm）
流速：1 mL/min
梯度：

时间（min）	流动相B（%）
0	5
5	20
20	60
25	95

检测波长：220 nm（肽键） & 280 nm（DOTA螯合剂）。

收集目标峰：DOTA-多肽分子量增加约 539.5 Da（理论值≈1968.21 Da），保留时间通常比未标记多肽延后2-5分钟。

步骤5：产物验证

质谱分析（MALDI-TOF MS）：

基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）
检测 [M+H]⁺ 峰：预期 m/z ≈ 1968.21（误差±1 Da）。

放射性标记（可选）：

将纯化产物溶于 0.1 M醋酸铵（pH 5.6），加入 5倍摩尔量⁶⁸GaCl₃，37°C孵育30分钟，γ计数器检测标记效率（＞95%为合格）。

关键参数优化表

参数	推荐值	调整范围	作用
多肽浓度	25 mM	10–50 mM	避免聚集，保证反应效率
DOTA-NHS比例	1 : 50（摩尔比）	1:10–1:100	降低副产物，兼顾成本
有机溶剂占比	90% DMSO	≥80%	抑制NHS酯水解，提高偶联率
反应pH	8.5	8.3–8.8	促进氨基去质子化（-NH₂）
反应温度	4°C	4–25°C	减少水解，保护热敏感多肽 ———————————————————————————

注意事项

副产物控制：

DOTA-NHS在pH 8.5时水解半衰期约30 min，需严格控制反应时间 ≤ 2 h。

多肽稳定性：

含半胱氨酸的多肽需添加 1 mM EDTA 防止氧化；难溶多肽可先用 5%醋酸助溶，再调pH至8.5。

标记位点选择性：

若多肽含多个赖氨酸，需通过质谱/MS-MS 确认标记位点，避免影响活性。

本方案基于文献的优化条件设计，实际收率约60–80%。首次尝试建议缩小规模至1/5量验证。

2025-06-03

8 仪器版

8.1 荧光显微镜 (IX73)

仪器设置：滤镜全用，光圈打到中间，不用聚光镜，通光孔选4，物镜选黄色10×，底部滤光片转盘选5，拨片抽出，肉眼观察和电脑扫描同时选，光强最大。

软件设置：8位sRGB，水平翻转和垂直翻转都勾上，伪彩关闭，增强：gamma 1，锐度3，对比度3，阴影矫正关闭。手动曝光，曝光时间100ms，感光度200。